拉曼显微镜指南
什么是显微拉曼？
关于拉曼显微镜
显微拉曼是传统光学显微镜和拉曼光谱仪独特的化学鉴别优势的有机组合体。
这两种分析技术本身都相当强大，但将他们结合在一起之后，则可能对最小物体（> 0.5 μm）进行化学分析，因此，这两种技术的结合将光谱与空间信息联系了起来。
与显微红外相比，显微拉曼更容易信号过饱和，因为显微拉曼使用的光需要与简单的玻璃光学器件兼容。因此，高质量的光学显微镜是显微拉曼研发的基础。
关于采样和共聚焦
通常，根据分析任务，显微拉曼不需要繁杂的样本预处理。通常来说，样品被直接放置在显微镜下。最多，将样品的横截面切平或者将大型工件切割到适合样品台尺寸就可以了。
然而，与拉曼光谱相同的样品限制仍然适用，样品不能产生强烈的荧光吸收或激发波长的吸收。
有些样品需要用到共聚焦显微拉曼，其在XYX三维上都有良好的空间分辨率。这样，就可以测量容器内部的物质（例如玻璃瓶）或以 3D 方式表征样品。
显微拉曼校准
为了获得精确和可靠的显微拉曼测试结果，波长轴的精确校准至关重要。显微拉曼的许多操作变化通常都会对波数准确性产生或多或少的不利影响。
（重新）校准通过测量单晶硅标准物质来进行，但SENTERRA II作为一款现代化的显微拉曼具备最方便智能的连续实时自动校准功能。
如果不具备连续校准功能，即使在激光器、光阑或光栅变化等看似轻微的仪器调整之后、突然撞击和振动以及温度漂移和变化后，也应该进行重新校准，以确保获得最准确的光谱数据。
什么是光谱分辨率？什么是空间分辨率？
光谱分辨率描述将光谱特征分开为单个元素的能力。如果光谱分辨率太低，一些光谱信号消失在宽的"吸收峰"中。
如果光谱分辨率太高，则测量时间比要求的时间要长得多，这对用户来说没有任何意义。因此，了解哪个光谱分辨率是特定样品的理想值非常重要。分辨率"过低"或"过高"取决于不同的应用需求和分析目标。
空间分辨率很重要，因为它会影响到我们看到样品的清晰度。在显微拉曼分析中，区分样品中的不同结构至关重要。因此，空间分辨率越好，可获得的信息越详细。
横向和纵向分辨率由各种指标参数所决定。为了在这两个方向实现最高的分辨率，必须使用共聚焦拉曼显微镜。通常来说，空间分辨率是拉曼成像中的关键参数。
什么是共聚焦？为什么共聚焦对拉曼如此重要？
在光学显微镜中，共焦意味着被照射的样本点和光束路径内的针孔有着共同的焦点。在实际应用中，与使用整个样品相反，只有一小部分的样品被点状光源照射。接着，针孔会阻挡未聚焦的光，从而增加对比度和景深。
什么是共焦拉曼显微镜？
该原理可应用于拉曼光谱，从而增强沿x、y-（横向）和z-轴（深度）的空间分辨率，同时还能够进行深度剖析。 不过，拉曼显微镜的共焦设计可能有所不同。
真共焦设计
真共焦拉曼显微镜的最大优势在于其具有独立的空间控制和光谱分辨率。这是通过在光谱仪入口狭缝前放置针孔而实现的。然后，可调节的针孔可以控制共焦度，入口狭缝则可控制光谱仪的光谱分辨率。 这种设计的缺点在于，很难通过使这个两个孔理想地对准，来确保最佳性能。
赝共焦设计
在简化的配置中，您可以通过一个方向上的入口狭缝和正交方向上的CCD探测器空间分辨率来控制空间分辨率。在空间分辨率方面，光谱仪的局限性会导致系统性能下降，但减少伪共聚焦装置中的光学元件数量，又能显著提高整体通量。
混合共焦设计(FlexFocus)
由于高通量和真共焦设计都能带来明显优势，拉曼显微镜可配备一个混合孔径阵列，该阵列包含一组针孔和狭缝，用于作为共焦孔径和光谱仪入口。这种混合设计将两种设计的优点合二为一，可按需进行真共焦或高通量设置。
关于拉曼显微镜的常见问题
拉曼光谱的优点？
与其他振动光谱技术（如FTIR和NIR吸收光谱）相比，拉曼有几个主要优势。与吸收光谱相反，拉曼效应是从样品表面散射来的非弹性光。因此，拉曼光谱在测量固体、液体和气体时不需要或很少需要制备样品。不仅测试时简单直接，而且还可以透过玻璃和塑料这类透明材料进行测试。水的拉曼信号非常弱，因此拉曼光谱可以轻松地检测溶解在水中的化合物，而不受强干扰。这使得拉曼光谱非常适合测试自然状态下的生物样品。
获得一张拉曼光谱所需要的时间？
曝光时间取决于许多因素，例如对拉曼光谱质量的要求、激光功率大小和样品横截面的平整度。通常来说，高质量的拉曼光谱可以在几秒钟内获得。
混合材料的拉曼光谱？
拉曼光谱中包含所有被测量的分子的信息。因此，混合物拉曼光谱中含有来自不同分子的拉曼吸收峰。如果知道所测试得成分，则可以从混合物拉曼光谱中得出定量信息。
除了化学结构，拉曼光谱还能测得如下信息？
拉曼光谱可以直接或间接地测得各种信息，如分子中的同位素、同素异形体、结晶度、多态性、晶格掺杂、张力、压力和温度。
拉曼光谱在定量分析中的应用
拉曼光谱的强度与样品浓度呈线性相关。峰强度和浓度之间的相关性可以通过已知样品进行校准。在混合物分析中，拉曼峰可以同时显示化合物浓度的定量信息。
适合应用的最佳激光波长
遗憾的是，针对特定应用的最佳激光波长也并不总是很明显地可以找到。在拉曼分析实验中，必须考虑许多系统变量来优化激发波长。散射效率、荧光的影响、检测器效率以及经济高效且易于使用的系统的适用性都是需要考虑的主要方面。最常用激光波长为 785 nm 和/或 532 nm。532 nm 特别适用于无机材料分析，如石墨烯和富勒烯。
拉曼测量的典型激光功率
显微拉曼测量样品的激光功率通常是零点几毫瓦到几十毫瓦不等。拉曼强度与激光功率成正比。但是，使用强激光功率时，样品被灼伤的风险会增加。降低激光功率可以避免样品损坏，但与此同时，我们需要更长的曝光时间，以获得高质量的拉曼光谱。
