Przewodnik po mikroskopii Raman
Co to jest mikroskopia Raman?
O mikorskopii Raman
Mikroskopia Raman (μ-Raman) to połączenie konwencjonalnej mikroskopii świetlnej i unikalnej identyfikacji chemicznej przez spektroskopię Raman.
Obie techniki są dość potężne same w sobie, ale razem oferują możliwość chemicznego badania najmniejszych obiektów (> 0,5 μm), a tym samym łączą dane spektralne z informacjami przestrzennymi.
W przeciwieństwie do mikroskopii podczerwieni, mikroskopy Raman są znacznie łatwiejsze prostsze, ponieważ używają światła, które jest kompatybilne z optyką szklaną. Dlatego też mikroskopy Raman są często opracowywane na podstawie bardzo wysokiej jakości mikroskopów optycznych.
O próbkowaniu i konfokalności
Ogólnie i w zależności od zadania analitycznego, w mikroskopii Raman nie są konieczne skomplikowane przygotowanie próbki. Zazwyczaj próbki są umieszczane pod mikroskopem, takie, jakie są. Co najwyżej, przygotowuje się przekroje poprzeczne lub przycina się duże elementy są cięte na wymiar, aby zmieścić je na stoliku pomiarowym.
Jednakże nadal obowiązują te same ograniczenia dotyczące próbek, co w spektroskopii Raman, tzn. próbka może nie wykazywać silnej fluorescencji lub absorbancji długości fali wzbudzenia.
Niektóre próbki wymagają konfokalnego mikroskopu Raman, który oferuje rozdzielczość przestrzenną we wszystkich trzech wymiarach. W ten sposób można dokonywać pomiarów wewnątrz pojemników (np. szklane fiolki) lub charakteryzować próbki w 3D.
Kalibracja mikroskopu Raman
Aby uzyskać precyzyjne i wiarygodne wyniki μ-Raman, niezbędna jest dokładna kalibracja osi długości fali. Wiele zmian operacyjnych mikroskopu Raman ma zwykle mają mniej lub bardziej poważne konsekwencje pod względem kalibracji liczby falowej.
(Re)Kalibracja jest przeprowadzana poprzez pomiar wzorca krzemowego, ale nowoczesne mikroskopy oferują ciągłą kalibrację dla maksymalnej wygody.
Jeśli nie jest wykonywana w sposób ciągły, to rekalibracja powinna być przeprowadzana regularnie, a nawet po pozornie drobnych regulacjach przyrządów, takich jak zmiany lasera, przysłony lub siatki, czy też po nagłych wstrząsach i wibracjach, a także zmianach temperatury, aby zapewnić pozyskiwanie optymalnych danych spektralnych.
Co to jest rozdzielczość spektralna? Co to jest rozdzielczość przestrzenna?
Rozdzielczość spektralna opisuje zdolność do rozdzielania cech spektralnych w ich poszczególnych elementach. Jeśli jest zbyt mała, niektóre sygnały spektralne znikają w szerokich "pasmach".
Jeśli jest zbyt duża, pomiar trwa znacznie dłużej niż jest to wymagane bez dodatkowych korzyści dla użytkownika. Dlatego ważne jest, aby wiedzieć, jaka rozdzielczość spektralna jest idealna dla danej próbki. To, co sprawia, że rozdzielczość jest "zbyt niska" lub "zbyt wysoka", zależy od aplikacji i wykonywanego zadania analitycznego.
Rozdzielczość przestrzenna jest ważna, ponieważ wpływa na to, jak ostro widzimy obiekty. W mikroskopii Raman ważne jest rozróżnienie struktur w próbce. Stąd, im lepsza rozdzielczość przestrzenna, tym bardziej szczegółowe informacje są uzyskiwa.
Rozdzielczość lateralna i osiowa zależy od różnych parametrów. Aby osiągnąć najwyższą rozdzielczość w obu obszarach, należy użyć konfokalnego mikroskopu Raman. Zazwyczaj rozdzielczość przestrzenna jest decydującym parametrem w obrazowaniu Raman.
Co to jest konfokalność? Dlaczego jest tak ważna dla Ramana?
W mikroskopii optycznej konfokalność oznacza, że oświetlone miejsce próbki i przysłona otworkowa w ścieżce wiązki mają ten sam punkt ogniskowy. W praktyce, zamiast całej próbki, tylko niewielka jej część jest oświetlona przez punktowe źródło światła. Następnie, otwór blokuje niezogniskowane światło, zwiększając w ten sposób kontrast i głębię ostrości.
Co to jest konfokalna mikroskopia Raman?
Zasada ta może być stosowana do spektroskopii Raman, zwiększając w ten sposób rozdzielczość przestrzenną wzdłuż osi x, y- (lateralna) i z (głębokość), umożliwiając jednocześnie profilowanie głębokości. Mikroskopy Raman mogą się jednak różnić w konstrukcji konfokalnej.
Prawdziwa konstrukcja konfokalna
Największą zaletą prawdziwego konfokalnego mikroskopu Raman jest niezależna kontrola rozdzielczości przestrzennej i spektralnej. Osiąga się to poprzez umieszczenie przysłony otworkowej przed szczeliną wejściową spektrometru. Zmienne przysłony otworkowe kontrolują stopień konfokalności, podczas gdy szczelina wejściowa steruje rozdzielczością spektralną spektrometru. Wadą tej konstrukcji są trudności napotkane podczas próby utrzymania obu przysłon w idealnym ustawieniu w celu utrzymania optymalnej wydakności.
Konstrukcja pseudo-konfokalna
W uproszczonej konfiguracji rozdzielczość przestrzenną można kontrolować za pomocą kombinacji szczeliny wejściowej w jednym kierunku, a rozdzielczość przestrzenną detektora CCD w kierunku ortogonalnym. Ograniczenia spektrografu prowadzą do gorszej wydajności, jeśli chodzi o rozdzielczość przestrzenną, ale zmniejszając liczbę optyki w konfiguracji pseudo-konfokalnej, ogólna przepuszczalność jest znacznie lepsza.
Konstrukcja hybrydowo-konfokalna (FlexFocus)
Zarówno, wysoka przepuszczalność i prawdziwa konstrukcja konfokalna oferują oczywiste zalety, mikroskop Raman może być wyposażony w hybrydową tablicę przysłonową zawierającą zestaw otworów i szczelin, które mogą działać jako przysłona konfokalna. Ta hybrydowa konstrukcja łączy w sobie zalety obu konstrukcji i umożliwia dostęp na żądanie do prawdziwej konfiguracji konfokalnej lub o wysokiej przepuszczalności.
Często zadawane pytania dotyczące mikroskopii Raman
Jakie są zalety spektroskopii Raman
Raman ma kilka głównych zalet w porównaniu do innych technik spektroskopii wibracyjnej, takich jak FTIR i NIR. W przeciwieństwie do absorpcji, efekt Ramana to nieelastyczne rozpraszanie światła od próbki. W rezultacie spektroskopia Raman praktycznie nie wymaga przygotowania próbki w pomiarach ciał stałych, cieczy i gazów. Nie tylko bezpośrednio, ale także przez przezroczyste materiały, takie jak szkło i plastik. Woda ma bardzo niski sygnał Ramana i dlatego spektroskopia Raman może łatwo wykryć związki rozpuszczone w wodzie bez silnych zakłóceń. To sprawia, że spektroskopia Raman jest odpowiednia do pomiarów próbek biologicznych w stanie macierzystym.
Jak długo trwa pozyskanie widma Raman?
Czas ekspozycji zależy od wielu czynników, takich jak oczekiwana jakość spektralna, moc lasera i przekrój próbki dla rozproszenia Ramana. Zazwyczaj dobrej jakości widma Raman można nabyć w ciągu kilku sekund.
Czy widma Raman można uzyskać z mieszanin?
Widmo Ramana zawiera informacje o wszystkich mierzonych cząsteczkach. Dlatego widma Ramana uzyskiwane z mieszaniny zawiera sygnały z różnych cząsteczek. Jeśli znane są widma składników, można uzyskać ilościowe informacje o składzie.
Co jeszcze można wykryć Ramanem poza strukturą chemiczną?
Spektroskopia Raman może dostarczyć bezpośrednio lub pośrednio, różne informacje, takie jak izotopy w cząsteczkach, allotropy, krystaliczność, polimorfizm, dopowanie w strukturze krystalicznej, napięcie, ciśnienie i temperatura.
Czy spektroskopia Ramana nadaje się do analizy ilościowej?
Intensywność widma jest liniowa do stężenia. Związek między najwyższą intensywnością a stężeniem można skalibrować za pomocą znanych próbek. W mieszaninach sygnały Raman dostarczają ilościowych informacji o stężeniu związków w tym samym czasie.
Jaka jest najlepsza długość fali lasera do mojego zastosowania?
Niestety, najlepsza długość fali laserowej dla konkretnego zastosowania nie zawsze jest oczywista. Aby zoptymalizować długość fali wzbudzenia w eksperymencie Raman, należy wziąć pod uwagę wiele zmiennych. Są to efektywność rozpraszania, wpływ fluorescencji, wydajność detektora, a także dostępność opłacalnego i łatwego w użyciu systemu. Najczęściej używana długość fali to 785 nm i/lub 523 nm. 532 nm nadaje szczególnie nadaje się do materiałów nieorganicznych, takich jak grafen i fullereny.
Jaka jest typowa moc lasera do pomiarów Raman?
Moc lasera na próbce pod mikroskopie Raman jest zawiera się w zakresie od sub-mW do kilkudziesięciu mW. Intensywność Raman jest wprost proporcjonalna do mocy lasera. Istnieje jednak zwiększone ryzyko uszkodzenia próbki przy użyciu dużej mocy lasera. Moc lasera można obniżyć, aby uniknąć uszkodzenia próbki, ale w ten sposób potrzebujemy dłuższego czasu ekspozycji, aby uzyskać dobrej jakości widma.
