DNP-NMR技术在膜蛋白样品研究中获得的灵敏度增强和分辨率再创新高

在不易形成具有生物活性形式结晶态的蛋白质及其他生物分子的结构研究领域，固体核磁共振波谱（ssNMR）有望替代 X 射线晶体学技术。

很多情况下，内在膜蛋白需要脂质双层来实现生物学相关的结构和功能。近年来，飞速固体核磁共振波谱(ssNMR)有望替代 X 射线晶体学技术。发展的固体核磁共振技术在确定内在膜蛋白的原子级结构这项应用上前景一片大好。然而，迄今为止，膜蛋白结构在蛋白质数据库中仍然无足轻重，仅占目前已知的近 12 万个结构的 1%。这种情况着实令人惊讶，尤其是考虑到膜蛋白在生物学中所扮演的各种功能性角色——从细胞识别、信号传输到转运蛋白。

高质量膜蛋白结构的缺乏，主要是因为难以在生物学相关的条件下制备样品，以及核磁共振的灵敏度或信噪比不能满足检测这些复杂混合物的需要。

通过将双自由基引入固体核磁样品，然后用与之相对应的电子顺磁共振（EPR）频率进行辐照，动态核极化（DNP）可将更大的电子极化转移至样品的核自旋，从而大幅提高核磁共振灵敏度。

自从引入了 DNP，该技术已在多种生物样品上实现了灵敏度的显著提升。

然而，直到最近，膜嵌合多肽和膜嵌合蛋白质上所得到的 DNP 增强因子还是差强人意，并且极不稳定。

抛弃了传统的离心技术相关的方法，Liao及其同事通过采用直接滴定法，将DNP双自由基添加到膜样品中。这种方法使得他们能大幅推动M2（M2TM）跨膜结构域的 DNP 增强。实验采用的M2是甲型流感病毒包膜上的质子选择性离子通道。

增强因子约为 100，加上绝对灵敏度相对于室温下固体核磁共振增加近 160 倍，使得膜样品的 DNP 表现达到了其他生物制剂的同等水平。

此外，膜嵌合多肽样品的DNP增强13C谱的线宽低至1.0 ppm，这是报道过的最小值，而且仅略低于较高温度下获得的非DNP增强谱图的线宽值。

该研究还报告了可用于未来的膜-DNP 研究的诸多重要发现：

• 双自由基的 AMUPol 表现比 TOTAPOL 高出 4 倍，与之前结果一致。
• 作为冷冻保护剂的丙三醇提供的增强因子比二甲基亚砜高 1.5 倍。
• 尽管使用氘化脂质组成的膜可能会得到更好的增强因子，但总体灵敏度不见得会比使用质子化脂质更高。
• 在无序肽区域，和DMPC脂质相比，DLPE脂质可以产生波动更大的肽共振峰。

利用脂质信号进行顺磁弛豫增强测量，还可量化 AMUPol 和 TOTAPOL 的膜嵌入深度。虽然这两种双自由基均在膜表面和膜表面层下方约 10Å 处出现了双位点结合模型，但 TOTAPOL 的膜嵌入部分大于 AMUPol，这有助于样品的进一步优化。凭借增强因子的提升和出色的分辨率，DNP 在推动膜蛋白结构生物学的快速发展方面具有巨大的前景。

参考文献：

1. Liao, S. Y.; Lee, M.; Wang, T.; Sergeyev, I. V.; Hong, M. Efficient DNP NMR Of Membrane Proteins: Sample Preparation Protocols, Sensitivity, and Radical Location. J Biomol NMR. 2016, 64(3), 223–237.
2. Hong, M.; Zhang, Y.; Hu, F. (2012) Annu. Rev. Phys. Chem. 63: 1-24
3. White, S. Membrane proteins of known 3D structure. http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/; accessed October 24, 2016.