通过配体观察核磁共振进行片段筛选

在这里，我们将展示如何以自动方式设置配体观察NMR筛选实验的各个实际方面，涉及以下三个基本实验：饱和传递差（STD）、水分子配体的梯度光谱观测（waterLOGSY），以及基于驰豫的方法（T1r和T2）。

配体观察NMR筛选实验：

• 大分子＞20 kDa在弛豫（T1和T2）以及奥弗豪塞尔核效应（NOE）方面表现出明显不同于片段（如小分子）的NMR特性。
• 由于与大分子的相互作用进而改变了片段的可观察NMR参数，因而与目标结合的配体均可与非结合物区分开来，这在所有配体观察筛选实验中都很常见。
• 使用基于NOE的方法侦测到的命中可以通过使用基于驰豫的方法来加以确认。
• 在蛋白质上停留期间以及由于结合时的化学交换，小分子适应了目标分子的弛豫特性。这可以用来区分结合物与非结合物。

T2/T1r – 驰豫法

大生物分子的T2和T1r弛豫时间比片段要短得多。通常对两种光谱进行测量和比较，一个具有10毫秒弛豫延迟，而另一个则具有200毫秒弛豫延迟。结合的片段可以通过光谱的比较来识别：

waterLOGSY

在WLOGSY实验中，通过NOE使极化从水分子转移到小分子。结合的配体与结合在蛋白质上的水相互作用，而非结合物只能“看见”溶剂水。然而，来自结合水的NOE效应具有与自由水相反的标志。其结果是，来自结合片段的信号与来自非结合物的信号相反。

饱和传递差（STD）

在STD实验中记录了两个光谱，（1）受选择性射频（RF）辐射的生物分子靶标光谱；（2）离共振辐射光谱。

源于RF辐射的靶标饱和通过NOE转移到结合配体上，导致在共振光谱中的强度降低。在（1）与（2）的不同光谱中，只能观察到来自结合物的信号。

NMR筛选的主要优点

• NMR技术无需蛋白质特异性设置或关于蛋白质功能的知识，并且可以应用于无法进行生物测定的目标；
• NMR技术应用于溶液时不受晶体接触或靶标固定化的影响；
• 可以侦测到低uM到mM的弱结合；
• 片段的QC，容易识别光谱中的降解

实验参数

在新版本的TopSpin 3.5 PL6中，WRSOY和STD参数集包含了优化的实验设置，以及自动获取和处理的例行程序（rpar WLOGSY_PREP、WLOGSY和STDDIFFESGP.3）。T2和T1r的参数集可根据要求提供（stefan.jehle@bruker.com）。

硬件参数

在新版本的TopSpin 3.5 PL6中，WRSOY和STD参数集包含了优化的实验设置，以及自动获取和处理的例行程序（rpar WLOGSY_PREP、WLOGSY和STDDIFFESGP.3）。T2和T1r的参数集可根据要求提供。

• 右图为各项实验的正确蛋白质浓度选择指南
• 蛋白质浓度和以及片段与蛋白质的比率高度依赖于蛋白质的分子量（MW）
• 蛋白质越大，则应选择更高比例
• 对于样品可用性低的目标，该比值可高达约1:200
• 片段式混合物的使用大大缩短了检测时间。每种混合物的典型片段数分别应＜10（1H筛选）及＜30（19F筛选）

结论

配体观察NMR是一种自动化的片段筛选技术，可在初级和次级筛选中产生高质量的命中。目前，可提供具有优化的测量条件的参数集，这有助于基于NMR的筛选实验的设置，既是新手也可掌握。此外的一个关键优点是来自1D 1H光谱的片段的QC，从而能识别化合物的降解和聚集，避免假阳性。这对于确认通过SPR或热位移进行的初级筛选命中特别有用。

进一步阅读：

A.D. Gossert和W. Jahnke；Prog. NMR Spect.；2016。

作者：

Stefan Jehle（1）、Helena Kovacs（1）、Till Kuehn（1）和Alvar Gossert（2）

（1）布鲁克拜厄斯宾有限公司，瑞士法兰登市伊杜斯特里大街26号，8117（Bruker BioSpin AG, Industriestrasse 26, 8117 Faellanden, Switzerland）；

（2）诺华生物医学研究所，瑞士巴塞尔市（Novartis Institutes for BioMedical Research, Basel, Switzerland）。