利用NMR确定保健品和能量饮料的纯度
营养饮料和能量饮料是使用天然产品的数十亿美元级的新兴产业。为了确保最终产品与标签一致并符合相关法规，制造商必须依靠高灵敏度的特定分析方法，如核磁共振（NMR）波谱，以确保免受污染物侵袭并保障质量。
简介
国际草药保健与治疗市场已成为一个价值数十亿美元的行业，预计到2015底将达到930亿美元的水平[1]，植物成分化合物的销售将随之相应上升。与传统药物相比，天然保健产品的使用的不断增长，主要是由于受其健康益处和相较于传统药物的成本节约的推动，这已引起了人们的关注，对通过在营养剂中掺假以提高功效或经济收益的可能性表示担忧。这种掺假也可能是无意之中造成的。在美国，另一个蓬勃发展的经济体是能量饮料市场，2011年市场规模达90亿美元。许多能量饮料中含有天然产品提取物，如人参、银杏和牛奶蓟，以及维生素（如烟酸和抗坏血酸）。因此，它们被归类为膳食补充剂，并必须遵守2007 FDA cGMP裁决，制造商必须确保其产品的身份、纯度、强度及其成分。显然，能够解决以上问题的分析方法是必不可少的，而基于NMR的筛选工具则已被证明是非常有效的。本文介绍了NMR的一些应用，涉及对RegenErect™、姿秀堂蜂花粉和琉璃苣油等保健品的掺假检测、产品真实性评价，以及Monster Energy® 饮料筛选。
样本选择
之所以选择保健饮料和能量饮料进行研究，原因是多种多样的。RegenErect是一种含有家蚕、牡蛎、枸杞和白柳树皮提取物的天然性功能增强产品，由于含有磺胺乙酰萘嘧啶（图1），一种未经批准的未经验证的西地那非类似物（图2），亦即Viagra®（伟哥）中的活性化合物，曾遭到FDA召回。
FDA还对姿秀堂蜂花粉进行过产品召回，据说它与对照物质西布曲明掺杂（图3），对有冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、心律失常或中风病史的患者存在显著的风险。
琉璃苣油是ɣ-亚麻酸（GLA）的主要来源，被用于预防和治疗包括骨质疏松症、糖尿病和癌症在内的多种临床疾病。然而，琉璃苣植物的种植十分昂贵，因此，出现了采用不含GLA的廉价红花油进行掺假的诱惑。在Monster Energy饮料的案例中，必须验证许多不同化合物的复杂混合物，以确保符合2007 FDA cGMP膳食补充剂法规。
NMR分析
营养保健品
在FDA发布掺假通告后，立即在线购买了姿秀堂蜂花粉和RegenErect，在实验室中向琉璃苣油中掺入0.1至10%的红花油。通过分别在含0.5mM 4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸（DSS）的1ml二甲基亚砜-D6（DMSO-d6）中溶解25mg 每种材料，制备出姿秀堂蜂花粉和RegenErect 的NMR检测样本。用氯仿（CDC13）制备琉璃苣油的NMR检测样本。
在298K下，使用AVANCE™ III 400 MHz NMR波谱仪（Bruker），通过其工作流程导向型TopSpin™ 3.2用户界面获取NMR数据。采用CPMG1d（1D模式下的珀塞尔-梅隆-吉尔序列）和NOESY1d（1D模式下的核奥弗豪斯效应谱）脉冲序列，64排/64K点/弛豫延迟分别为4s和10s。NMR数据的自动评估采用Assure™ – Raw Material Screening (RMS) v1.5软件，通过与波谱库匹配亦即化学计量学分析来识别样本成分。采用Assure-RMS软件进行量化，依靠PULCON[2]（基于脉冲长度的浓度测量）来提供“经校准的NMR波谱仪”。NMR波谱仪的线性度以及NMR信号与产生信号的原子数的比例性，使得校准可达到单个量化标准样本。由于无需匹配消光系数或离子化效率，使得定量校准可应用于其它化合物。
能量饮料
从16盎司听装Monster Energy饮料中取400µl试样，与200µl的D2O（氘氧化物）磷酸盐缓冲液混合，放置在盛有1µl混合液（300mM D2O中的DSS）的NMR管内。从Bruker Biofluid Reference Compound（Bruker生物流体参考化合物数据库）或内部波谱数据库中获取已知饮料成分的NMR波谱。
所有的NMR实验均采用AVANCE III 600 MHz波谱仪，298K，5mm TCI CryoProbe™（Bruker）探针。1H NMR波谱与0.00ppm下的DSS参照。313K设定温度/32排/64K点/20s弛豫延迟，获取标准1H NOESY波谱，采集时间为13分钟。所有波谱均为自动获取、处理和分析，使用Assure-RMS v1.5对样本进行筛选。使用交互式方法Builder界面对Monster Energy饮料进行目标筛选方法评估；使用波谱基础构建器为Monster Energy饮料中的单个化合物创建波谱数据库。
结果与讨论
营养保健品
采用靶向自动筛选对RegenErect进行分析，使用含磺胺乙酰萘嘧啶的NMR谱数据库来确定未申报药物化合物的存在与否。除2011年FDA经认定的RegenErect补充事实中列出的成分，即家蚕、白柳树皮、枸杞和牡蛎提取物外，还检测了大量磺胺乙酰萘嘧啶。定量分析是基于8.00、7.92和7.44 ppm的波峰进行的（图4，表1）。
基于靶向NMR筛选，还利用Assure-RMS对姿秀堂蜂花粉进行了类似分析。从两个不同批次号中取六个样本，通过与含潜在产品成分的波谱数据库进行比较，针对西布曲明进行检测。尽管包装标记有“GMP”和“防伪”，但NMR波谱清楚地显示了存在大量未在补充事实中申报的材料（图5）。
将靶向NMR筛选方法应用于以红花油掺假的琉璃苣油检测，并用多变量化学计量学工具Assure-RMS来确定红花油的受污染程度。根据图7可知，100%琉璃苣油和100%红花籽油的NMR波谱具有显著的相似性，但在某些化学位移区存在一定的差异，如1.7、2.0和2.8ppm。然而在行业中，以琉璃苣油名义销售的产品中很少有采用100%红花油掺假的，例如，含10%掺假成分的混合物更为常见。
表2中的每种溶液的重复样本（n＝5）是用于校准Assure-RMS偏最小二乘法（PLS）模型，并进行琉璃苣/红花混合物的内部交叉验证（图8）（12 PLS成分，R2＝0.99，交叉验证的均方根误差[RMSECV]＝0.017）。
来自两个掺假琉璃苣油样本的自动结果（表3）显示了红花油实际量和预测量之间良好的相关性。
能量饮料
图9显示了Monster Energy饮料的1H NMR谱，观察到大量波谱共振。利用由Assure-RMS生成的NMR波谱数据库确定出各种特定成分，包括糖、兴奋剂、有机酸和草本提取物。每个样本在波谱数据库中自动筛选化合物，并对这些物质进行验证。图10显示了覆盖在Monster Energy饮料波谱上的单个化合物的化学位移区域。
对峰值多重态和线形分析的详细研究有助于确认化合物标识并进行量化（表4）。在本项研究中鉴定出了人参提取物，但未进行量化。
NMR非常适合于对草药保健品的评估；因为每种植物材料都有其独特的指纹图谱，所以药物掺假物在1H NMR波谱中通常是非常明显的。使用自动NMR协议易于进行质量控制，从而可以报告其身份、纯度、强度和成分。NMR的高再现性使得使用波谱数据库成为可能，这是使用靶向NMR筛选方法自动识别掺假物的关键，通过线形分析或PLS回归可对各种成分进行量化。
对于诸如能量饮料之类的复杂混合物，NMR波谱能以最小的样本制备量来可视化单种成分，并且无需分离。作为一种基于NMR的自动筛查工具，可以成为验证在能量饮料中发现的大量膳食补充剂的有力方法，为行业与监管部门提供产品评估和质量控制的有效手段。
参考文献：
- 来源：San Jose；基于CA的全球行业分析师，
- Wider, G.和Dreier, L.；“通过NMR波谱检测蛋白质浓度”；J Am Chem Soc； 128(8): p. 2571-2576。
- Jeffery J.等；“用于治疗肥胖症的新型环丁基烷基胺——西布曲明及其主要人类代谢物的合成”；J Chem Soc Perkin Trans 1； 21: p. 2583-2590。
- Vaysse, J.等；“利用DOSY 1H-NMR分析减肥药中的掺假草药和膳食补充剂”；食品添加剂污染Part A化学分析控制博览会风险评估；2010. 27(7): p. 903-916。
