利用新的固体NMR方法研究蛋白质骨干分配

简介

由于正在进行的一系列发展，包括更高的磁场强度（如Bruker AVANCE 1000 MHz NMR波谱仪）、更先进的探测技术（如正在朝着更小的转子尺寸发展）、更高的魔角旋转（MAS）速率，以及选定的脉冲序列，固态核磁共振（NMR）波谱技术正日趋完善。

固态NMR位点特异性蛋白质表征与结构鉴定的关键步骤是耗时的共振分配。最常见的残基内与残基间分配2D和3D实验，使用同核13C-13C偶极再耦合序列（如质子驱动自旋扩散（PDSD [1, 2]）或偶极辅助旋转共振（DARR [3]）以及特定异核15N-13C磁化转移[4]结合13C-13C转移（如NCαCx，NCOCx）。

在后一种情况下，在一个氨基酸残基“i”内从Cα到CO，以及从给定残基‘i’的CO到前一个残基‘i-1’的Cα的磁化转移，对于蛋白质骨干分配都是必不可少的（图1）。

以前，这种同核13C-13C转移主要是通过将偶极再耦合序列（如PDSD或DARR）添加到特定NCx序列来完成的。最近，Adam Lange及其同事引入了稳健而高效的、基于偶极的基带选择性同核交叉极化（BSH CP）在CO与Cα自旋之间转移磁化。[5-7]

该技术对于仅可在中等MAS速率下测量的氘化以及质子化蛋白质（例如，由于缺少小转子直径的探针、受限的信噪比等）具有特别意思。

BSH CP作为一种一级耦合机制，通过偶极截断可有效抑制不希望的序列长程CO-Cα以及Cα-Cα磁化转移。此外，不同于传统NCxCx序列，没有出现不希望的向Cβ共振的转移（与图2A相比较）。合理的3D实验可以在一天之内记录下来。[5-7]

本文（支持应用记录）介绍了一组BSH CP实验，以方便波谱记录，并简化分配过程，同时对必要参数进行了详细描述。

BSH CP – 实验

通过与Adam Lange及其同事的合作，Bruker提供了五种不同的BSH CP脉冲程序（‘PPG’），从1D到4D：

• 1D-3D hNCαCO（图2B，ppg: ‘hNCaCO3D.bsh’）
• 1D-3D hNCOCα（图2C，ppg: ‘hNCOCa3D.bsh’）
• 1D-4D hNCOCαCβ（图3A，ppg: ‘hNCOCaCb4D.bsh’）
• 1D-4D hCαNCOCα（图3B，ppg: ‘hCaNCOCO4D.bsh’）
• 1D-3D hCα(N)COCα（图3B，ppg: ‘hCa_n_COCa3D.bsh’）

hNCαCO是唯一提供残基内相关性的实验，而所有其它序列则均能提供序列残基间的相关性（图1）。最后两个实验包含两个特定的双CP转移步骤，将相邻的Cα共振相互关联起来。

结合这些实验，快速蛋白质骨干分配是可能实现的，结合进一步的实验可阐明二级和三级蛋白质结构。

BSH CP脉冲序列

一般来说，所有的BSH CP实验都遵循相同的脉冲序列结构（图2B、C和3）。初始磁化源于1H的90°激发脉冲（黑），随后是初始CP转移（浅蓝）。虽然在前三个实验中，这是一种H-N极化转移，实验四和五使用H-Cα CP。在任何情况下，初始CP之后就是特定的双CP转移（深蓝），从N到Cα或CO，或从Cα到N。在实验四和五中，后续的是进一步的特定双CP，从N到CO（图3B，紫）。

最终，通过BSH CP（浅红）实现同核C-C转移，包括从Cα到CO或从CO到Cα。hNCOCαCβ实验包括另一种同核转移，将某个残基的Cα与其侧链的Cβ原子相关联。在这里，使用斜坡形状的DREAM（通过振幅调制的偶极再耦合增强，[8]）转移被证明是最为有效的（图5B）。[7]

在演化期间（t1 – t4）使用高功率1H解耦（浅灰）。在特定的双CP和BSH CP转移过程中，连续波（CW，深灰）1H解耦有效。JCN解耦是由中心180°13C或15N脉冲（演化期间）和低功率15N解耦（获取期间）提供的

最后，还有两个重要的修整脉冲。第一个（红色填充）应用于CO-Cα BSH CP之前，为CO-Cα转移预备CO磁化。每当要检测CO信号以预备CO磁化以实现最大化检测时，第二个脉冲（红色框）是十分重要的。以下将介绍这两种脉冲背后的理论。

选择哪些实验条件？

BSH CP方法依赖于中等MAS速率（≤ 26 kHz）和高外部磁场强度Bo（≥ 600 MHz），这是因为频带选择性仅在CO和Cα间的各向同性化学位移差（Δ）大大超过MAS速率νR时才起作用。

通常，典型的CO和Cα共振分别出现在大约174ppm和54ppm，导致120ppm的化学位移差（Δppm）。对于从ppm到Hz（ΔHz）的转换，必须考虑13C回磁比γC和外部磁场Bo：

例如，在600 MHz波谱仪上，13C上的120ppm的化学位移差大约等于18kHz：

ΔHz = 120ppm ×0.25×600MHz = 18000 Hz

重新研究方程（1）表明，仅低于18 kHz的MAS速率可用于BSH CP实验：

ΔHz = 18 kHz > νR

在开始任何BSH CP实验之前，应该仔细考虑外部磁场Bo、转子尺寸，以及由此产生的MAS速率。适当实验设置的详细叙述汇总在表1中。

参数优化

Cα/ Call/ CαCβ resonances). Here, the use of Bruker’s TopSolidsbio leads to fast results.

一旦选择了这些实验条件，需要优化某些参数。90°硬脉冲：1H、13C，和15N、HC CP、HN CP、1H高功率解耦、NCα双CP、NCO双CP、CαN双CP、1H CW解耦，以及不同偏移频率（CO/ Cα/ Call/ CαCβ共振中心）。在这里，Bruker的TopSolidsbio的应用可快速获得结果。

最后，在其1D ppg版本中，BSH CP特定参数（CP接触时间和功率水平、必要时的第一和第二修整脉冲长度，详细信息参见表2）需要进行优化。

所提供的Bruker脉冲程序包括关于精心选择的参数设置的详细信息。此外，Bruker提供了一个名为‘calcbshcp’的脚本，该脚本可基于所选择的实验条件自动计算出所有相关的BSH CP参数。不过，在以下段落中还给出了对手动参数设置的理论概述和公式。

如何实现CO-Cα频带选择性CP转移

对于两个不同核之间的交叉极化，需要满足Hartmann-Hahn（HH）条件。对于同核BSH CP同样如此。

当作用于CO和Cα上的有效场强（Beff）的和或差等于MAS速率（νR）的一或两倍时，可以实现零量子（ZQ，n＝1）与双量子（DQ，n=2）的同核再耦合。实验数据表明，与ZQ转移相比，DQ可提供更高的转移效率。[5, 6]

自旋X的有效场（Beff,x）由所施加的RF辐射场（B1）和来自载频（在TopSpin中被称为偏移‘o1’，图4A, B）的化学位移偏移（Ω）所决定：

CO和Cα的13C ΔHz由方程（2）可知。因此，如果在BSH CP转移期间载频被设置在两个共振频带（CO或Cα）中的任何一个上，则化学位移差等于偏移：

Ω = Δ Hz

实验结果表明，Cα共振频带不太依赖于共振位置，而CO化学位移分散对有效场的影响更大，并能迅速导致BSH CP条件的失配。[5]RF辐射的载频应始终设置在Cα频带的中间保持共振（图4A, D），从而产生有效Cα场（Beff，Cα等于所施加的B1场）：

Beff，Cα = B1

依靠化学位移偏移和MAS速率的知识，能计算出可实现CO和Cα间的BSH CP转移（＝‘BBSH’）的RF场强度B1。当选择有利的DQ转移时，HH条件（方程（3））：

2×vR = Beff,CO +Beff,Cα.                                     (3)

研究方程（5）方程（3）可以解出Beff,CO：

Beff,CO = 2×vR −BBSH.                                         (3)

方程（3）等同于方程（4）：

2×vR –BSH = BSH2+ΔHz2)1⁄2        (3=4)

解出BBSH，BSH CP条件所需的场强：

重新研究前一页的例子，我们知道ΔHz是18kHz。以15kHz旋转时，满足HH条件的BSH CP旋转锁定脉冲变为：

表1的最后一列汇总了建议实验条件所对应的有效场B1。

CO-Cα BSH CP的CO修整脉冲

在包含从Cα到CO极化转移的BSH CP序列中，CO磁化在BSH CP之前沿Z排列。由于从CO到Cα的化学位移偏移，与Cα共振的RF辐射场（BBSH）将CO磁化直接翻转到所需的Beff,CO方向上（XZ平面，浅红）以满足HH条件（比较图4B和D）。

另一方面，在包含从CO到Cα的极化转移的BSH CP序列中，Cα磁化沿Z排列，而CO磁化在特定NCO CP（图2，深蓝）之后沿X取向。因此，通过沿着X施加BBSH，CO的有效场不会翻转到CP转移所需的方向上，而是保持沿着X方向。

因此，修整脉冲必须先于BSH CP将将CO磁化翻转成BBSH的有效非共振CO场（BEFF,CO）（图2和图4C，D）。这可以通过施加与CO共振带发生共振的硬修整脉冲来完成（图2C中的红色填充脉冲，在Bruker脉冲程序中被称为‘P28’）

所需的翻转角度θ计算如下：

在我们的示例中，翻转角度为：

翻转角度通常为62-63°。关于13C 90°脉冲长度（Bruker脉冲程序中的‘P1’），P28计算如下：

假设13C 90°脉冲强度为55.6kHz（对应于4.5μs的脉冲长度），则62°翻转脉冲所需长度为：

CO检测的修整脉冲

每当检测到CO信号，例如在hNCαCO中，而且在2D hNCOCα中也是如此，则必须施加另一个修整脉冲（图2，红框内脉冲，在Bruker脉冲程序中称为‘P29’）。在任何其它实验中，如果已在间接维度中（例如在3D hNCOCα形式中）检测到CO，则不需要第二个修整脉冲，因为它只会最大化CO-CO峰斜线，而无CO-Cα交叉相关峰。[5-7]如在相关ppg中所描述的，通过在‘zgoptns’中设置‘-Dflip’标志，可为不同维度激活修整脉冲。

图5描述了BSH CP期间有效场（A）和磁化（B）的位置，而Cα磁化（MCα,BSH）沿X方向旋转锁定，CO磁化（MCO,BSH，对应Beff,CO）位于XZ平面（浅红），但需要翻转到XY平面进行检测。

为了进一步旋转锁定Cα磁化以进行检测，只能沿X方向施加第二个修整脉冲（Btrim2）。在这些条件下，当其正好对准Y轴时（导致CO信号与Cα信号相比发生90°移相），只能检测到最大剩余CO磁化。

如图5B所示，在BSH CP之后，MCO,BSH垂直于Y轴（紫色平面）。因此，为了将CO磁化翻转到Y轴上（MCO，在trim2后），只允许沿X的修整脉冲，产生一个有效场（Beff2,CO），它与MCO（trim2后）和MCO,BSH两者都垂直。图5C显示，必须沿-X方向施加Btrim2以产生此Beff2,CO。MCO,BSH与X轴之间的夹角等于Beff2,CO与Z轴之间的夹角（θ）。

在方程（7）中，θ可以表示为：

联立方程（7）和（9），可以解出第二修整脉冲的漏磁场强：

由于有效场Beff2,CO从MCO,BSH变化了90°，所以Btrim2的计算振幅需要转换为90°脉冲的长度。最后，P29变为：

对于我们这个例子，这意味着Btrim2场和p29长度：

最后，当施加7.4μs的射频场强度BBSH时，我们这个例子中可检测出CO磁化。

参考文献

1. M. Szeverenyi等；“二维傅立叶变换13C交叉极化魔角旋转的旋转变换观测”；J Magn Reson (1982) 47:462-475。
2. G. Pines等；“固态中稀自旋的质子增强NMR”；J Chem Phys (1973) 59:22。
3. Takegoshi等；“魔角旋转NMR中的13C-1H偶极辅助旋转共振”；Chem Phys Lett (2001) 344:631-637。
4. Baldus等；“倾斜框架中的交叉极化：异核旋转系统中的分配和波谱简化”；Mol Phys (1998) 95:1197-1207。
5. Chevelkov等；“频带选择性同核交叉极化高度氘化蛋白质中的高效CO-CA转移”； J Magn Reson (2013) 230:205–211。
6. Chevelkov等；“质子化蛋白中的高效带选择性同核CO-CA交叉极化”；J Biomol NMR (2013) 56:303–311。
7. Shi等；“基于BSH-CP的蛋白质共振分配3D固态NMR实验”；J Biomol NMR (2014) Epub ahead of print。
8. Verel等；“基于绝热通道技术的固态NMR同核自旋对滤波器”；Chem Phys Lett (1998) 287:421-428。