Przewodnik po mikroskopii FT-IR

Technika, która pozwala mikroskopii podczerwieni analizować i identyfikować próbki, jest taka sama jak w przypadku spektroskopii FT-IR. Najpierw światło podczerwone świeci na próbkę i wchodzi z nią w interakcję. To światło IR jest następnie wykrywane w celu utworzenia widma FT-IR, które jest jak "chemiczny odcisk palca" próbki. Informacje zawarte w widmie mogą być wykorzystane do identyfikacji, scharakteryzowania i ilościowego określenia różnych substancji znajdujących się w próbce.

W zależności od próbki, analizę FT-IR można przeprowadzić na kilka sposobów:

• Transmisja
• Odbicie
• Osłabione całkowite wewnętrzne odbicie (ATR)

W przypadku transmisji promieniowanie podczerwone przechodzi całkowicie przez próbkę, a następnie jest wykrywane. Aby wykorzystać transmisję w mikroskopii FT-IR, próbki muszą być zazwyczaj przygotowane w określony sposób, np. cienko pocięte za pomocą mikrotomu. Odbicie jest wykorzystywane do analizy próbek stałych, w których promieniowanie podczerwone jest odbijane od powierzchni próbki, a następnie wykrywane. Może również analizować bardzo cienkie próbki, które są umieszczone na odblaskowym podłożu, takie jak cienkie tkanki lub powłoki.

Ponieważ zarówno odbicie, jak i transmisja mają pewne ograniczenia związane z przygotowaniem próbki, inna technika stała się standardem w mikroskopii FT-IR: całkowite osłabione wewnętrzne odbicie (ATR). ATR kieruje promieniowanie podczerwone przez kryształ, zwykle wykonany z germanu, który naciska na próbkę.

Promieniowanie podczerwone oddziałuje z pierwszymi kilkoma mikronami próbki, a następnie przechodzi z powrotem przez kryształ w celu wykrycia. ATR jest najczęściej stosowaną techniką pomiarową, ponieważ może mierzyć wiele różnych typów próbek, wymaga niewielkiego lub żadnego przygotowania próbki i zapewnia doskonałą rozdzielczość, gdy jest używana w mikroskopii.

Mikroskop FT-IR ma w sobie więcej niż tylko spektrometr FT-IR. Przyjrzyjmy się zatem, jak dokładnie możemy połączyć mikroskop z tą potężną techniką identyfikacji chemicznej.

Aby połączyć spektrometr FT-IR i mikroskop, zarówno światło widzialne, jak i promieniowanie podczerwone muszą być w stanie poruszać się przez mikroskop, aby świecić na próbkę. Stanowi to jednak wyzwanie od samego początku. Wynika to z faktu, że mikroskopia świetlna zwykle wykorzystuje szkło do wielu elementów mikroskopu, takich jak szkiełka do próbek i soczewki obiektywowe. Promieniowanie podczerwone nie może jednak przenikać przez szkło!

Istnieją dwie możliwości obejścia tej przeszkody. Po pierwsze, soczewki i elementy mikroskopu mogą być wykonane z materiałów, przez które promieniowanie podczerwone może łatwo przechodzić. Jednak bardziej powszechnym rozwiązaniem jest użycie szeregu luster, zwykle wykonanych z aluminium, do kierowania światła przez mikroskop. Starannie rozmieszczone zwierciadła mogą być nawet wykorzystywane do tworzenia obiektywów Cassegraina.

Dzięki odpowiedniej optyce światło widzialne może dotrzeć do próbki, a część mikroskopowa urządzenia działa zgodnie z oczekiwaniami. Patrząc na próbkę za pomocą mikroskopu, wybiera się jej obszar do analizy FT-IR. Wykorzystując ATR, transmisję lub odbicie, promieniowanie podczerwone oddziałuje z próbką w obszarze zainteresowania, a następnie jest kierowane do detektora. Zanim jednak promieniowanie podczerwone dotrze do detektora, przechodzi przez przysłonę, aby zapewnić, że tylko światło podczerwone odpowiadające obszarowi zainteresowania dotrze do detektora w celu analizy.

Gdy promieniowanie podczerwone dotrze do detektora, tworzone jest widmo FT-IR. Daje to wiele informacji chemicznych o próbce w obszarze zainteresowania. Oprogramowanie komputerowe może nawet automatycznie zidentyfikować skład chemiczny próbki w wybranym regionie.

Istnieje kilka opcji detektorów, które można wykorzystać w mikroskopii FT-IR, które można podzielić na dwie podstawowe kategorie: detektory jednoelementowe i detektory obrazujące. Detektory jednoelementowe są używane do badania określonych obszarów w próbce, podczas gdy detektory obrazujące są używane do tworzenia obrazów chemicznych. Obrazowanie chemiczne to temat zasługujący na osobny artykuł, więc skupimy się tutaj na detektorach jednoelementowych.

Istnieją trzy rodzaje jednoelementowych detektorów powrzechnie wykorzystywanych w mikroskopie IR:

• DLaTGS
• TE-MCT
• LN-MCT

Detektory deuterowane siarczanem trójglicyny, domieszkowane L-alaniną (DLaTGS) są niezwykle wszechstronnymi detektorami, które nie wymagają chłodzenia do działania, co czyni je bardzo łatwymi w użyciu. Nie mogą one jednak tworzyć wysokiej jakości widm dla bardzo małych próbek lub gdy używana jest bardzo mała apertura.

Do analizy mniejszych obszarów lub mniejszych próbek, poniżej 100 µm, można użyć termoelektrycznie chłodzonego detektora z tellurku kadmu i rtęci (TE-MCT). Ten rodzaj detektora jest stale chłodzony przez element Peltiera, nie wymaga konserwacji ani kriogeniki.

Do analizy najmniejszych próbek o wielkości 10 µm lub mniejszej najlepszym rozwiązaniem są detektory MCT chłodzone ciekłym azotem (LN-MCT). Jednak po napełnieniu detektora ciekłym azotem może minąć trochę czasu, zanim detektor schłodzi się wystarczająco do użycia. Detektory te wymagają również najwięcej pracy przy konserwacji, ponieważ ciekły azot musi być stale uzupełniany, gdy mikroskop jest używany przez dłuższy czas.

Przysłony są ważnym elementem mikroskopu FT-IR, ponieważ pozwalają nam selektywnie analizować promieniowanie podczerwone, które oddziałuje z interesującym nas obszarem próbki. Istnieją dwa rodzaje apertur, które mogą być używane do usuwania niepożądanego promieniowania IR przed detekcją: apertury otworkowe i apertury nożycowe (knife-edge).

Przysłona otworkowa to najprostsza i najtańsza opcja. Składa się z koła z okrągłymi otworami o różnych rozmiarach. Koło jest po prostu obracane, aby wybrać rozmiar otworu, który najlepiej nadaje się do danego eksperymentu. Przysłony nożowe są droższe, ale znacznie bardziej precyzyjne.

Przysłona typu knife-edge składa się z prostokątnego otworu z czterema ostrzami, z których każde może być poruszane niezależnie. Ostrza te są używane do dokładnego wyboru obszaru zainteresowania na próbce.

Apertury typu Knife Edge mają tutaj przewagę, ponieważ obszar zainteresowania można precyzyjnie wybrać, aby do detektora docierało tylko promieniowanie podczerwone odpowiadające temu obszarowi. Przysłony otworkowe mogą jedynie w przybliżeniu przepuszczać światło odpowiadające obszarowi zainteresowania, ponieważ kształt przysłony nie może być kontrolowany.

Mimo to należy zauważyć, że stosując przysłonę "wyrzucamy" promieniowanie podczerwone. Oznacza to, że zastosowanie bardzo małej przysłony (np. 50 µm) będzie wymagało bardzo czułego detektora. Oczywiście w niektórych przypadkach można wydłużyć czas pomiaru, ale wyniki będą się różnić.

Gdy promieniowanie podczerwone dotrze do detektora, tworzone jest widmo FT-IR. Daje to wiele informacji chemicznych o próbce w obszarze zainteresowania. Oprogramowanie komputerowe może nawet automatycznie zidentyfikować skład chemiczny próbki w wybranym regionie.

Do tworzenia tych obrazów w podczerwieni wykorzystywane są specjalne detektory do obrazowania, które zapewniają wydajne tworzenie obrazu w wysokiej rozdzielczości. Istnieją dwa rodzaje detektorów obrazujących: detektor ogniskowej matrycy (FPA) lub detektor linijkowy. Detektory te mogą jednocześnie rejestrować wiele widm FT-IR w polu widzenia. Jednak jedynie FPA mają zdecydowaną przewagę w obrazowaniu chemicznym, ponieważ są szybsze, bardziej precyzyjne i mogą być kalibrowane laserowo.

Mikroskopia FT-IR jest niezwykle przydatna w każdej aplikacji, która wymaga analizy próbki, która jest mała, cienka lub wymaga precyzyjnych pomiarów. To sprawia, że jest to technika wskazana do badania cząstek, folii i powłok, niezależnie od tego, czy chodzi o kontrolę jakości, analizę błędów, analizę konkurencji czy badania zaawansowane.  

Analiza cząstek jest niezbędna w wielu branżach w celu sprawdzenia zanieczyszczeń, a także jest kluczową częścią badań środowiskowych w celu zbadania zanieczyszczenia. Badacze środowiska ścigają się obecnie, aby zrozumieć skład cząstek mikroplastiku znajdujących się w naszej wodzie, glebie i powietrzu, aby lepiej zrozumieć wpływ tego rodzaju zanieczyszczeń. Mikroskopia FT-IR jest ważną techniką do badania mikroplastiku, ponieważ może szybko określić skład chemiczny małych cząstek w prawie każdym rodzaju próbki.

Mikroskopia FT-IR jest również ważną techniką do przeprowadzania analizy wielowarstwowej w celu określenia zarówno składu, jak i grubości warstw. Jest to powszechnie wykonywane na przykład w przemyśle polimerowym, gdzie wielowarstwowe i kompozytowe materiały muszą być analizowane w celu zapewnienia, że materiały są wykonane zgodnie ze specyfikacją i są wolne od wad.  

Podobnie, mikroskopia IR doskonale sprawdza się w analizie cienkich powłok. W przemyśle produkty takie jak powłoki antykorozyjne na metalach, warstwy kleju na opakowaniach lub powłoki diamentowe na wiertłach muszą być sprawdzane pod kątem jednorodności i zanieczyszczenia.

Istnieją również dziedziny, takie jak kryminalistyka, które wykorzystują mikroskopię FT-IR do analizy szerokiej gamy próbek, ponieważ nawet najmniejszy szczegół może być ważny w tej dziedzinie. Najmniejsze włókna i cząsteczki muszą zostać zidentyfikowane, aby mogły zostać wykorzystane jako dowód. Analiza wielowarstwowa musi być przeprowadzona w celu zidentyfikowania próbek farby, aby rozwiązać sprawy potrąceń i ucieczek. Większe próbki mogą być nawet badane w celu wykrycia podróbek.  

Zastosowania mikroskopii FT-IR dotyczą szerokiego zakresu branż. Oczywiście, po dodaniu obrazowania chemicznego, różnorodność zastosowań staje się jeszcze bardziej zróżnicowana i obejmuje takie zastosowania, jak skanowanie dużych próbek pod kątem wad, obrazowanie dużych próbek tkanek lub całych tabletek farmaceutycznych jednocześnie.

1. Czym jest mikroskopia FT-IR?

Jest to zastosowanie pomiaru FT-IR do próbki mikroskopowej. Łączy więc tradycyjną mikroskopię i analizę chemiczną w jednym narzędziu. Idealnie sprawdza się w analizie błędów i materiałoznawstwie.

2. Dlaczego mikroskopia FT-IR potrzebuje przysłon?

Ponieważ w mikroskopii IR stosowane są bardzo czułe detektory, ważne jest, aby unikać przesycenia detektora IR. Dodatkowo, apertury pozwalają dopasować plamkę pomiarową do rozmiaru próbki, aby uzyskać znacznie lepsze widmo. Wyobraźmy sobie płatek polietylenu o wielkości 10 µm osadzony wewnątrz matrycy PET. Jeśli w takim przypadku użyłbyś apertury 30 µm zamiast dopasowanej 10 µm, wynikowe widmo zawierałoby znacznie większy udział matrycy PET niż zanieczyszczenia PE.

3. Jaki jest najmniejszy obiekt, który można analizować za pomocą mikroskopii FT-IR?

Zależy to od zastosowanego mikroskopu, detektora i techniki pomiarowej. Jednak HYPERION, wyposażony w detektor FPA i wykorzystujący mikroskopię ATR, może analizować obiekty na granicy dyfrakcji promieniowania podczerwonego, a więc ≤ 1 µm.

3. Dlaczego kryształ Germanowy ATR zwiększa rozdzielczość??

German ma (w porównaniu do wielu innych materiałów ATR) bardzo wysoki współczynnik załamania światła. Ponieważ jest on w bezpośrednim kontakcie z próbką, oznacza to, że działa jak stała soczewka imersyjna. Zwiększa to rozdzielczość przestrzenną o współczynnik 4 (współczynnik załamania światła) w porównaniu do standardowych pomiarów transmisji.

4. Czym jest obrazowanie FT-IR?

Obrazowanie FT-IR jest jednym ze sposobów tworzenia wspomnianych przestrzennie rozdzielonych obrazów chemicznych. Każdy piksel tych obrazów składa się z całego widma IR. Interpretując poszczególne widma, można wykryć i ocenić interesujące regiony próbki.